Kidney filtration barrier components nephrin and Neph3 : transcriptional regulation and role in cell adhesion

Glomerular epithelial cells, podocytes, and the specialized cell junctions termed slit diaphragms (SDs) between interdigitating foot processes of the podocytes form the essential components of the filtration barrier in the kidney glomerulus. Nephrin is a transmembrane immunoglobulin superfamily member and a crucial structural and signalling component of the SD. Mutations in the nephrin gene cause congenital nephrotic syndrome of the Finnish type (CNF), leading to disruption of the SD and leakage of plasma proteins into the urine. The Neph-protein family comprises Neph1, Neph2 and Neph3; these are nephrin homologues and also important components of the SD. Interactions between nephrin and Neph1-3 are suggested to play a role in cell adhesion and thus serve as a structural framework of the SD. This thesis investigated the interactions and cell adhesion activities of nephrin and Neph-family members. Neph3 was shown to belong to the nephrin protein complex and to form homodimers. Both Neph1 and Neph3 were demonstrated to participate in the formation of cell-cell contacts by their homophilic interactions. Cell adhesion was also promoted by heterophilic trans-interactions between nephrin and Neph1 or Neph3. These adhesive activities may play an important role in the formation and function of the SD. In nephrin-deficient mice, where SDs are replaced by tight junction-like structures, Neph3 was shown to be up-regulated. This suggests that Neph3 may be involved in molecular mechanisms that are associated with morphological changes in injured podocytes. Nephrin and Neph3 genes, NPHS1 and KIRREL2, respectively, are located on human chromosome 19q13.12 in a head-to-head orientation separated by an approximately 5-kb intergenic region. A similar bidirectional arrangement of nephrin and Neph3 genes is present in mouse and rat chromosomes. The bidirectional and conserved arrangement of nephrin and Neph3 genes together with their similar protein structure and location suggest that nephrin and Neph3 genes may share key features in their regulation. This thesis focused on investigating transcriptional regulatory mechanisms important for nephrin and Neph3 genes. Transcription factors WT1 and NF-κB were shown to function co-operatively in both nephrin and Neph3 gene regulation. Further, DNA methylation participated in silencing both nephrin and Neph3 gene expression. These similar mechanisms in regulating transcription of nephrin and Neph3 genes may produce their similar spatial and temporal expression as well as similar function. In addition, transcription factors GABP and Sp1 were found to regulate nephrin and Neph3 genes, respectively. The results of this thesis widen the current understanding of the role of nephrin and Neph-family members in the formation of the SD; Neph3 belongs to the nephrin protein complex sharing similar binding properties with nephrin, Neph1 and Neph2, and interactions of nephrin, Neph1 and Neph3 promote cell adhesion. Further, nephrin and Neph3 genes were demonstrated to share similar transcriptional regulatory mechanisms. This may improve understanding of the transcriptional regulation of podocytes in general.Munuaisen tehtävänä on suodattaa verestä haitallisia kuona-aineita ja erittää ne virtsan mukana pois elimistöstä. Suodatus tapahtuu munuaiskeräsissä suodatuskalvon läpi joka koostuu endoteelisoluista, tyvikalvosta ja monihaaraisten epiteelisolujen, podosyyttien, välisistä soluliitoksista eli välihiloista. Munuaisen suodatusmekanismin häiriintyminen näkyy valkuaisaineiden erittymisenä virtsaan, valkuaisvirtsaisuutena, joka jatkuessaan saattaa johtaa dialyysihoitoa tai munuaissiirtoa vaativaan munuaisvaurioon. Välihila koostuu useista munuaisen suodatustoiminnassa tärkeässä roolissa olevista proteiineista, joista yksi on nefriini. Mutaatio nefriiniä koodaavassa geenissä aiheuttaa suomalaistyyppistä synnynnäistä nefroosia (CNF), joka johtaa välihilojen puuttumiseen ja voimakkaaseen valkuaisvirtsaisuuteen. Sairautta hoidetaan munuaissiirrolla varhaisessa iässä. Välihilassa ilmentyy ainakin kolme nefriinin kaltaista proteiinia, Neph-proteiinit Neph1, Neph2 ja Neph3. Nefriinin ja Neph-proteiinien välisillä interaktioilla oletetaan olevan tärkeä rooli soluadheesiossa ja siten myös välihilan rakenteessa ja toiminnassa. Väitöskirjatyössä tutkittiin nefriinin ja Neph-proteiinien interaktioita ja roolia soluadheesiossa. Työssä osoitettiin, että Neph3 sitoutuu nefriiniin ja sen muodostamaan proteiinikompleksiin. Lisäksi osoitettiin, että Neph1 ja Neph3 pystyvät yksin indusoimaan soluadheesiota, kun taas nefriinin pitää sitoutua vastakkaisen solun pinnalla olevien Neph1:n tai Neph3:n kanssa, jotta solukontaktit muodostuisivat. Havaitsimme myös, että Neph3:n ilmentymistaso lisääntyy sellaisten hiirten podosyyteissä, joilta puuttuu nefriini. Nefriiniä ja Neph3:a koodaavat geenit, NPHS1 ja KIRREL2, sijaitsevat ihmisen kromosomissa 19 ainoastaan noin 5 kb:n etäisyydellä toisistaan siten, että niiden transkriptio tapahtuu vastakkaisiin suuntiin. Geenien samanlainen järjestäytyminen on säilynyt ainakin hiiren ja rotan kromosomissa. Nefriinin ja Neph3:n geenien järjestäytyminen sekä niiden proteiinien samankaltainen rakenne ja toiminta viittaavat siihen, että nefriinin ja Neph3:n geenejä saatetaan säädellä samalla tavoin. Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin nefriinin ja Neph3:n geenien transkriptionaalista säätelyä. Työssä osoitettiin, että transkriptiotekijät WT1 ja NF-κB kooperatiivisesti säätelevät kummankin geenin transkriptiota. Lisäksi havaittiin, että DNA:n metylaatio voi vaimentaa molempien geenien ilmentymistä. Transkriptiotekijän GABP osoitettiin ilmentyvän podosyyteissä ja säätelevän nefriinin geenin transkriptiota ja transkriptiotekijän Sp1 osallistuvan Neph3:n geenin transkriptionaaliseen säätelyyn. Väitöskirjatyössä tehdyt tutkimukset tuovat uutta tärkeää tietoa välihilan rakenteesta ja nefriinin ja Neph3:n geenien ilmentymiseen vaikuttavista säätelymekanismeista. Neph3:lla näytettiin olevan samankaltaisia toiminnallisia ominaisuuksia nefriinin ja muiden Neph-proteiinien kanssa, ja nefriinin ja Neph3:n geenien ilmentymistä näytettiin säädeltävän samanlaisilla mekanismeilla. Nefriinin ja Neph-proteiinien adhesiivisilla ominaisuuksilla saattaa olla tärkeä rooli välihilan rakenteessa ja toiminnassa. Samanlaiset säätelymekanismit nefriinin ja Neph3:n geenien transkriptiossa saattavat vaikuttaa siihen, että näiden geenien koodaamien proteiinien ilmentyminen ja toiminta ovat samankaltaisia. Nefriinin ja Neph3:n geenien säätelyn tarkempi tietämys voi auttaa ymmärtämään paremmin podosyyttien transkriptionaalista säätelyä ja toimintaa yleisellä tasolla. Väitöskirjatyön tulokset saattavat auttaa uusien hoitomuotojen tunnistamisessa

Co-stimulation with IL-1β and TNF-α induces an inflammatory reactive astrocyte phenotype with neurosupportive characteristics in a human pluripotent stem cell model system

Without abstract.Absztrakt nélkül

Munuaisen suodatuskalvon proteiinien, erityisesti densiinin, vuorovaikutusten tutkiminen

Munuaisten tärkein tehtävä on suodattamalla poistaa elimistöstä hyötykäyttöön sopimattomia aineenvaihduntatuotteita. Tämä tapahtuu munuaiskeräsessä erityisen suodatuskalvon läpi. Munuaiskeräsen virtsatilan puolella sijaitsevia epiteelisolujen jalkalisäkkeitä yhdistää erikoinen kalvorakenne (engl. slit diaphragm), joka on yksi suodatuskalvon osista. Kalvorakenteella on erittäin tärkeä rooli veren ultrasuodatuksessa estäen proteiinien vuotamisen virtsaan. Kalvorakenne muistuttaa tavanomaista solujen välistä ns. adherenttiliitosta ja koostuu sekä toiminnallisista että rakenteellisista proteiineista. Tämän proteiinikompleksin tuntemus on parantunut merkittävästi viime vuosien aikana, mutta sen täydellinen rakenne on vielä selvittämättä. Yksi uusimmista kalvorakenteesta löydetyistä proteiineista on densiini. Tämän diplomityön tarkoituksena oli selvittää densiinin toiminnallista merkitystä munuaisen kalvorakenteessa. Työn kirjallisuusosassa on esitelty munuaisen suodatuskalvon rakenne ja toiminta. Kalvorakenteen proteiinikompleksin rakenne on esitelty painopisteenä tärkeimmät ja parhaiten karakterisoidut proteiinit. Densiiniä on tarkasteltu yksityiskohtaisemmin. Lisäksi on tarkasteltu tällä hetkellä proteiinien vuorovaikutusten tutkimuksessa käytettyjä menetelmiä. Työn kokeellisessa osassa tutkittiin densiinin vuorovaikutuksia suodatuskalvon proteiinien kanssa. Työssä tuotettiin erilaisia GST (glutationi S-transferaasi) yhdistelmäproteiineja densiinistä, joiden avulla pyrittiin karakterisoimaan beta-kateniinin sitoutumiskohta densiinissä. Vuorovaikutustutkimukset tehtiin GST pull-down analyysillä, jossa käytettiin GST-densiini yhdistelmäproteiineja sitomaan ihmisen munuaisesta eristetyistä munuaiskeräsistä densiinin kanssa vuorovaikutuksessa olevia proteiineja. Lisäksi tutkittiin densiinin vuorovaikutuksia P-cadheriinin ja nefriinin kanssa tutkimalla näiden proteiinien esiintyvyyttä pull-down fraktioissa. Tässä työssä osoitettiin, että densiini on suorassa vuorovaikutuksessa adherenttiliitosproteiinien, beta-kateniinin ja P-kadheriinin kanssa ihmisen munuaiskeräsessä. Lisäksi nefriinin osoitettiin olevan samassa kompleksissa näiden proteiinien kanssa. Tärkeimmäksi beta-kateniinin sitoutumiskohdaksi densiinissä osoitettiin aminohappojen 1311-1360 määrittämä osa. Havaittiin, että täydelliseen vuorovaikutukseen tarvitaan densiinin karboksyylipää, joka kattaa aminohapot 1242-1537. Tulokset osoittivat, että densiinillä voi adhesiivisten ominaisuuksien johdosta olla merkittävä rooli kalvorakenteessa vaikuttaen esimerkiksi proteiinikompleksin oikeanlaiseen rakentumiseen. Tulosten perusteella esitettiin uusi proteiinikompleksimalli kalvorakenteen proteiineille. Densiinin vuorovaikutusten tunteminen edesauttaa koko proteiinikompleksin rakenteen ja toiminnan ymmärtämistä. Lisäksi densiinin vuorovaikutukset auttavat ymmärtämään densiinin merkitystä kalvorakenteessa ja vaikutusta erityisesti munuaissairauksissa

Laminin α5 substrates promote survival, network formation and functional development of human pluripotent stem cell-derived neurons in vi

Laminins are one of the major protein groups in the extracellular matrix (ECM) and specific laminin isoforms are crucial for neuronal functions in the central nervous system in vivo. In the present study, we compared recombinant human laminin isoforms (LN211, LN332, LN411, LN511, and LN521) and laminin isoform fragment (LN511-E8) in in vitro cultures of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neurons. We showed that laminin substrates containing the α5-chain are important for neuronal attachment, viability and network formation, as detected by phase contrast imaging, viability staining, and immunocytochemistry. Gene expression analysis showed that the molecular mechanisms involved in the preference of hPSC-derived neurons for specific laminin isoforms could be related to ECM remodeling and cell adhesion. Importantly, the microelectrode array analysis revealed the widest distribution of electrophysiologically active neurons on laminin α5 substrates, indicating most efficient development of neuronal network functionality. This study shows that specific laminin α5 substrates provide a controlled in vitro culture environment for hPSC-derived neurons. These substrates can be utilized not only to enhance the production of functional hPSC-derived neurons for in vitro applications like disease modeling, toxicological studies, and drug discovery, but also for the production of clinical grade hPSC-derived cells for regenerative medicine applications

Cell culture chamber with gas supply for prolonged recording of human neuronal cells on microelectrode array

Background Typically, live cell analyses are performed outside an incubator in an ambient air, where the lack of sufficient CO2 supply results in a fast change of pH and the high evaporation causes concentration drifts in the culture medium. That limits the experiment time for tens of minutes. In many applications, e.g. in neurotoxicity studies, a prolonged measurement of extracellular activity is, however, essential. New method We demonstrate a simple cell culture chamber that enables stable culture conditions during prolonged extracellular recordings on a microelectrode array (MEA) outside an incubator. The proposed chamber consists of a gas permeable silicone structure that enables gas transfer into the chamber. Results We show that the culture chamber supports the growth of the human embryonic stem cell (hESC)-derived neurons both inside and outside an incubator. The structure provides very low evaporation, stable pH and osmolarity, and maintains strong signaling of hESC-derived neuronal networks over three-day MEA experiments. Comparison with existing methods Existing systems are typically complex including continuous perfusion of medium or relatively large amount of gas to supply. The proposed chamber requires only a supply of very low flow rate (1.5 ml/min) of non-humidified 5% CO2 gas. Utilizing dry gas supply makes the proposed chamber simple to use. Conclusion Using the proposed culture structure on top of MEA, we can maintain hESC-derived neural networks over three days outside an incubator. Technically, the structure requires very low flow rate of dry gas supporting, however, low evaporation and maintaining the pH of the culture.acceptedVersionPeer reviewe